|
|
Aktivace protinádorové imunitní odpovědi s pomocí bispecifických fúzních proteinů
Chytrá, Gabriela ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Přirozené zabíječské buňky (NK buňky) jsou lymfocyty vrozeného imunitního systému, které rozeznávají a eliminují transformované, potenciálně škodlivé, buňky v mechanismu zvaném imunitní dohled. Maligně transformované buňky se snaží imunitnímu dohledu uniknout a v případě že uspějí, dojde k rozvoji rakovinného onemocnění. Pro obnovení imunitního rozpoznávání maligních buněk lze použít imunoterapii na bázi NK buněk využívající terapeutické bispecifické fúzní proteiny. Terapeutické fúzní proteiny cílí tumorové markery exprimované na povrchu maligních buněk a zároveň stimulují imunitní odpověď prostřednictvím vazby na aktivační receptor NK buněk, např. receptor NKG2D nebo NKp30. Relevantním příkladem tumorového markeru je HER2 receptor, který je často nadměrně exprimován u několika typů nádorových onemocnění a zejména u karcinomu prsu. Tato práce popisuje přípravu několika bispecifických fúzních proteinů s potenciálním využitím v imunoterapii. Bispecifické fúzní proteiny sestávají z aktivačního ligandu NK buněk (ligand MICA nebo B7-H6) a nanoprotilátky cílící vybraný tumorový marker (HER2 receptor), které jsou spojeny flexibilní glycin-serinovou spojkou. Konstrukty těchto fúzních proteinů byly připraveny ve dvou prostorových uspořádáních - s nanoprotilátkou situovanou na N-konci a ligandem na C-konci a...
|
|
|
Studies on structure and biological functions of NKR-P1 receptors
Rozbeský, Daniel ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Drbal, Karel (oponent)
Významnou součástí imunitního systému jsou NK buňky, které jsou schopny rozpoznávat a zabíjet některé nádorové a virem infikované buňky. Rozpoznávání abnormálních buněk je zprostředkováno sofistikovaným repertoárem aktivačních a inhibičních receptorů, které se nachází na povrchu NK buněk. Mezi nejznámější receptory patří rodina C-lektinových receptorů NKR-P1, o kterých se předpokládá, že jsou transmembránové proteiny II. typu vyskytující se na membráně v podobě disulfidicky vázaných homodimerů. Ačkoliv od jejich objevu uplynulo více než 20 let, jejich struktura a funkce je stále zahalená rouškou tajemství. Cílem disertační práce byl strukturní výzkum myších NKR-P1 receptorů za účelem poznat jejich funkce. V první části jsme vyvinuli metodu pro přípravu rekombinantních receptorů myší rodiny NKR-P1. Dále jsme se detailně zabývali receptorem NKR-P1A, jehož struktura byla vyřešena pomocí rentgenové strukturní analýzy s rozlišením 1,7 A. Unikátní vlastností struktury byla smyčka extendovaná z konzervované C-lektinové domény, která v krystalu interagovala se symetricky sdruženou molekulou. Konformace a flexibilita smyčky byla dále studována v roztoku pomocí vodík/deuteriové výměny a chemického síťování ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Jednotlivé analýzy potvrdily, že struktura NKR-P1A se v roztoku liší od...
|
|
|
Spontánní regrese melanomu prasat linie MeLiM
Plánská, Daniela
Melanom je kožní nádor vznikající z melanocytů - kožních buněk nesoucích pigment melanin. Melanom patří mezi imunogenní nádory, s čímž je také pravděpodobně spojen poměrně hojný výskyt částečné spontánní regrese (SR). Melanoma-bearing Libechov Minipig (MeLiM) představují speciálně vyšlechtěný zvířecí modelový organismus, který je postižen většinou nodulárními melanomy podléhajícími u zhruba 2/3 nemocných zvířat úplné SR. Položili jsme si tedy otázku, jakou úlohu hraje ve SR melanomu linie MeLiM imunitní reakce spojená s destrukcí nádorových buněk a též proteiny asociované s extracelulární matrix (ECM), jejichž změna exprese odráží přestavbu destruované nádorové tkáně. Realizovali jsme rozsáhlou časosběrnou studii, ve které jsme u kožních melanomů odebraných od jedinců linie MeLiM ve stáří 3, 4, 6, 8, 10, 12, 20 a 32 týdnů (5-10 vzorků v každé věkové kategorii) imunohistochemicky sledovali expresi kolagenu IV, lamininu, fibronektinu, tenascinu C i MMP-2 a průtokovou cytometrií jsme monitorovali zastoupení základních subpopulací imunitních buněk v krvi a v nádoru. Vyšší exprese kolagenu IV, lamininu a MMP-2 pozitivně korelovala s přítomností melanomových buněk. Exprese kolagenu IV i lamininu v oblastech s melanomovými buňkami naznačovala možné přežívání nádorových buněk díky interakci se zmíněnými...
|
|
|
Spontánní regrese melanomu prasat linie MeLiM
Plánská, Daniela ; Horák, Vratislav (vedoucí práce) ; Smetana, Karel (oponent) ; Bartůňková, Jiřina (oponent)
Melanom je kožní nádor vznikající z melanocytů - kožních buněk nesoucích pigment melanin. Melanom patří mezi imunogenní nádory, s čímž je také pravděpodobně spojen poměrně hojný výskyt částečné spontánní regrese (SR). Melanoma-bearing Libechov Minipig (MeLiM) představují speciálně vyšlechtěný zvířecí modelový organismus, který je postižen většinou nodulárními melanomy podléhajícími u zhruba 2/3 nemocných zvířat úplné SR. Položili jsme si tedy otázku, jakou úlohu hraje ve SR melanomu linie MeLiM imunitní reakce spojená s destrukcí nádorových buněk a též proteiny asociované s extracelulární matrix (ECM), jejichž změna exprese odráží přestavbu destruované nádorové tkáně. Realizovali jsme rozsáhlou časosběrnou studii, ve které jsme u kožních melanomů odebraných od jedinců linie MeLiM ve stáří 3, 4, 6, 8, 10, 12, 20 a 32 týdnů (5-10 vzorků v každé věkové kategorii) imunohistochemicky sledovali expresi kolagenu IV, lamininu, fibronektinu, tenascinu C i MMP-2 a průtokovou cytometrií jsme monitorovali zastoupení základních subpopulací imunitních buněk v krvi a v nádoru. Vyšší exprese kolagenu IV, lamininu a MMP-2 pozitivně korelovala s přítomností melanomových buněk. Exprese kolagenu IV i lamininu v oblastech s melanomovými buňkami naznačovala možné přežívání nádorových buněk díky interakci se zmíněnými...
|
|
|
Inhibitory NK cell receptors and possibilities of manipulation of cytotoxic properties.
Švubová, Veronika ; Frič, Jan (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
Akutní myeloidní leukémie tvoří 18 % všech leukémií u dětských a mladých dospělých pacientů. V první vlně léčby remise dosahuje přibližně 80-90 % pacientů a přežití se blíží 70 %, nicméně k relapsům dochází až v 50 % případů a prognóza těchto pacientů je extrémně špatná. Léčba relapsu je pak velmi náročná, protože přetrvávající leukemické klony mohou být zcela rezistentní k chemoterapii. V poslední době začaly být jako atraktivní terapeutický nástroj pro léčbu relapsů vnímány NK buňky. NK buňky jsou jednou ze subpopulací lymfoidních buněk, které mají schopnost eliminovat dysfunkční buňky prostřednictvím cytotoxických aktivit a následně dále indukovat imunitní odpověď. Jednou z výhod NK buněk je jejich funkční nezávislost na specifických antigenech. Ve světle rostoucích důkazů o úloze leukemických kmenových buněk v kontextu akutní myeloidní leukémie se zdá, že NK buňky nabízejí novou perspektivu v terapeutickém úsilí o jejich eliminaci prostřednictvím několika cytotoxických mechanismů. I přes optimistické předběžné výsledky se však léčba tohoto onemocnění ukázala jako poměrně náročná a imunoterapie založená na NK buňkách stále naráží na několik omezení. Transformující růstový faktor β je částečně zodpovědný za udržování populací leukemických kmenových buněk a narušení imunitní odpovědi...
|
|
|
Příprava vazebné domény proteinu B7-H6 s vysokou afinitou
Jeníček, Jakub ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Přirozeně zabijácké buňky jsou součástí přirozené imunity a hrají důležitou roli při ochraně organismu. Zásadní jsou v obraně před nádorovými onemocněními a případně v protinádorové terapii. Proto jsou tyto buňky dlouhodobě předmětem mnoha výzkumů, neboť nádorová onemocnění představují celosvětově jednu z nejčastějších příčin úmrtí. Léčba těchto onemocnění bývá často složitá a invazivní, a proto je výhodné hledat nové terapeutické přístupy, které by využívaly již existující obranné mechanismy. Jedním z klíčových mechanismů, který NK buňky využívají pro rozpoznávání nádorových buněk a jejich eliminaci je receptor NKp30. Tento receptor může po vazbě aktivačního ligandu vyvolat cytotoxickou odpověď, která vede k likvidaci nádorové buňky. Jedním z aktivačních ligandů tohoto receptoru je protein B7-H6, jenž se přirozeně vyskytuje na povrchu buněk některých nádorů. Přesná podstata interakce B7-H6 a NKp30 však není dosud dokonale popsána. Tato práce se zabývá různými metodami přípravy fluorescenčně značené domény B7-H6, která by umožňovala vizualizaci receptoru NKp30 na povrchu buněk, čímž by přispěla k lepšímu popisu interakce těchto molekul. KLÍČOVÁ SLOVA NK buňky, NKp30, B7-H6, sortasa A, HEK293
|
|
|
Role N-glykosylace v homooligomerizaci receptoru přirozené cytotoxicity NKp30
Tulpa, Matouš ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Bělonožníková, Kateřina (oponent)
NK buňky hrají klíčovou roli v boji proti buňkám, které byly napadeny virem, prvokem nebo podlehly maligní transformaci. Kromě toho také regulují aktivitu a množství dalších buněk imunitního systému. Cílové buňky rozpoznávají pomocí svých aktivačních a inhibičních receptorů, ze kterých přijímají aktivační a inhibiční signály, na nichž je závislá cytotoxická odpověď NK buňky. Mezi signály panuje dynamická rovnováha, která rozhoduje o životě a smrti cílové buňky. Pokud převáží aktivační signály, bude cílová buňka eliminována. Pokud převáží inhibiční signály, pak cytotoxická odpověď nenastane. Receptor NKp30 patří do superrodiny receptorů podobných imunoglobulinům. Jedná se o důležitý aktivační receptor, který rozpoznává celou řadu ligandů, mezi které patří hemaglutinin viru vakcinie a ektromélie, protein pp65 lidského cytomegaloviru, B7-H6, BAG-6 a galektin-3. Extracelulární doména receptoru NKp30 je za určitých podmínek schopna v roztoku homooligomerizovat. První podmínkou je přítomnost N-glykosylace, druhou podmínkou je přítomnost 15 aminokyselin dlouhé "stalk" domény, která propojuje ligand vázající doménu s transmembránovým α-helixem. Cílem této práce bylo ověřit, které ze třech dostupných míst N-glykosylace receptoru NKp30 je zodpovědné za jeho homooligomerizaci. Dalším cílem byla biofyzikální...
|
|
|
Rekombinantní exprese potkaního NK buněčného receptoru Clr-b v přítomnosti fluorovaných analogů monosacharidů
Urbanová, Zuzana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
NK buňky jsou buňkami nespecifické imunity, které kromě likvidace tělu vlastních poškozených buněk také produkují chemokiny a cytokiny, kterými zasahují i do imunity specifické, stojí tedy na pomezí obou těchto druhů imunity. NK buňky na svém povrchu exprimují aktivační a inhibiční receptory, jejichž rovnováha udržuje buňku v inaktivovaném stavu, narušení této rovnováhy spustí cytotoxické mechanismy buňky. Dvěma z potkaních inhibičních receptorů NK buněk jsou receptory NKR-P1B a NKR-P1D, jejichž ligandem je protein Clr-b, což je receptor z rodiny proteinů podobných lektinům typu C. Cílem práce bylo rekombinantně připravit tento protein v prostředí sedmi fluorovaných analogů monosacharidů jakožto potenciálních inhibitorů N-glykosylace proteinu. Protein byl úspěšně exprimován v buněčné linii HEK293T ve formě konstruktu obsahujícího kromě extracelulární části Clr-b také Fc fragment lidského IgG a histidinovou kotvu, a to několikrát, pokaždé v prostředí jednoho ze sedmi fluorovaných analogů monosacharidů. Vzhledem k tomu, že glykosylace proteinů má výrazný vliv na jejich funkčnost, se inhibice glykosylace se jeví jako vhodné terapeutické řešení mnoha nemocí včetně například roztroušené sklerózy či rakoviny. Cílem zde bylo posoudit vliv fluorovaných analogů monosacharidů na přirozenou N-glykosylaci...
|
|
|
Produkce a charakterizace mutované formy galektinu-3
Dubanych, Yurii ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Přirozeně zabijácké buňky (NK buňky, z angl. natural killer) jsou velké granulární lymfocyty vrozené imunity, které jsou charakterizovány schopností zabíjet rakovinné a virem poškozené buňky bez předchozí aktivace. Cytotoxické funkce NK buněk jsou regulovány jednak prostřednictvím povrchových receptorů rozpoznávajících molekuly MHC-I, jednak přítomností sady aktivačních a inhibičních receptorů, které jsou mezi sebou za normálních podmínek v rovnováze. Osud cílové buňky proto záleží nejen na expresi MHC-I, ale i na expresi ligandů aktivujících receptory NK buněk. Jedním z aktivačních receptorů NK buněk je NKp30. Pro NKp30 byly objeveny tři specifické buněčné ligandy: lidský athanogen 6 asociovaný s BCL-2 (BAG-6, také známý jako BAT3), nádorový antigen B7-H6 a nově objevený ligand galektin-3. Všechny tyto ligandy jsou často exprimovány rakovinnými buňkami, přičemž BAG-6 a Gal-3 působí na funkce NK buněk inhibičně, což může být mechanismem úniku nádoru před imunitním systémem. Proto je Gal-3 novým potenciálním cílem léků, které inhibicí Gal-3 mohou napomáhat imunitnímu systému bránit se proti maligně transformovaným buňkám. Tato bakalářská práce zahrnuje ověření vlivu mutace Cys173 - Ser173 v sacharid vazebné doméně galektinu-3 na vazbu receptoru NKp30 pomocí gelové permeační chromatografie. Dále se...
|
|
|
Příprava mutovaných forem proteinu B7-H6
Malá, Viktorie ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Bělonožníková, Kateřina (oponent)
Přirození zabijáci zvaní NK buňky (z angl. Natural Killers) jsou velmi podstatnou součástí imunitního systému. Jsou to tzv. přirození zabíječi, nesou na svém povrchu řadu receptorů. Pro imunitní dohled jsou zásadní dva typy receptorů dle funkce zvané inhibiční a aktivační. Inhibiční receptory zajišťují autotoleranci. Druhým typem jsou aktivační receptory, jejichž aktivace vede ke spuštění cytotoxické odpovědi, případně k zapojení dalších složek imunitního systému (např. makrofágů). Aktivační receptor NKp30 (označovaný také jako NCR3 nebo CD337) je protein z rodiny přirozeně cytotoxických receptorů (NCR, z angl. Natural Cytotoxicity Receptors). Je jedním z hlavních lidských NK-buněčných aktivačních receptorů s potenciálním využitím v cílené protinádorové terapii. Aktivačním ligandem receptoru NKp30 je protein B7-H6, který se běžně nevyskytuje na povrchu zdravých buněk. Vyskytuje se výhradně na buňkách, které jsou výrazně stresované, tedy např. na infikovaných nebo maligně transformovaných buňkách. Nese-li maligně transformovaná buňka na svém povrchu B7-H6, dojde ve většině případů k jejímu rozpoznání a eliminaci takřka ihned při jejím vzniku. Protože však ne všechny nádorové buňky jsou B7- H6 pozitivní, nabízí se možnost jejich zviditelnění pro imunitní systém právě skrz dekoraci proteinem B7-H6....
|
host ::
RSS.